包埋苯甲酸钠微球的制备及在海洋防污涂料中的抑菌研究

史 航1, 2 , 石建高1 , 陈晓蕾1 , 刘永利1 , 王鲁民1*
( 11 中国水产科学研究院东海水产研究所, 农业部海洋与河口重点开放实验室, 上海 200090;21 东华大学材料科学与工程学院纤维材料改性国家重点实验室, 上海 200051)

海洋中存在大量海洋生物及微生物, 这些生物的幼虫和孢子能够漂浮游动, 发展到一定阶段后就附着在海上设施, 例如船体、浮标、桥墩、码头、网箱及网具等上, 称为海洋生物污损( marine biofo uling) , 生物污损可以使舰船航速降低, 增加燃料消耗, 壳体腐蚀加速[ 1] ; 附着在养殖网箱上造成养殖网箱网衣堵塞, 减少海水的流动交换, 造成网箱内水体环境变差, 导致养殖对象疾病多发。抑制海洋生物污损常用的方法是使用防污涂料, 通过涂料中可释放的铜、锡、汞、铅在材料周围形成对海洋植物孢子以及海洋动物幼虫有毒杀作用的毒料浓度层[ 2] , 从而达到防污效果。但这些重金属及有害物质的释放严重污染海洋环境[ 3, 4] , 因此, 有毒防污涂料的使用已受到许多国家立法限制[ 5~ 7] ; 加快开发无毒海洋防污技术, 有效控制海洋污损的是目前需求解决的重要难题。

苯甲酸钠已被证明可以充当海洋污损过程中接触反应抑制剂而不杀死污损生物[ 8] , 有研究[ 9] 证明苯甲酸钠分子能抑制微生物细胞呼吸酶系统活性, 特别是对乙酰辅酶缩合反应有很强的抑制作用; 另外, 苯甲酸钠还可以影响细胞膜保持合适的pH 值的能力, 从而导致细胞酸化并破坏新陈代谢过程; 静态生物实验[ 10] 证明苯甲酸钠对微生物有麻痹( 无毒) 作用; Mir ta 等[ 11] 研究发现苯甲酸钠对藤壶幼虫有麻痹作用, 当被麻痹幼虫重新被移至新鲜的人造海水中时, 会恢复活动。我们课题组在苯甲酸钠对东海区典型污损细菌种类的抑制作用方面也做了相关研究[ 12] 。另一方面, 涂料中防污剂的释放速度对海洋防污涂料的效果有直接影响, 很多涂料在使用初期效果良好, 但是不能持续, 使得涂有防污涂料的物体表面再经过一段时间的浸海后, 由于防污的有效成分释放速度初期较快, 造成后期几乎没有释放, 使得材料表面被海洋生物附着污损。因此, 如何控制防污剂的长效释放是保证防污涂料耐污损效果持久的关键。目前美国、日本都在积极致力于把可控释放技术应用于海洋防污涂料的研究, 美国海洋研究室从20 世纪90 年代初开始进行防污涂料的控制释放研究, 他们用镀铜微管作为控释释放载体, 对四环素等药物进行包埋;Price[ 13] 研究了微球包封天然海洋防污活性物质及其防污性能的改善; 国内中国海洋大学的付玉彬教授课题组研究了铜微球[ 14] 以及纳米钛酸管[ 15] 对防污剂异噻唑酮的控释作用。本文采用聚苯乙烯微球对无毒海洋防污剂苯甲酸钠进行包埋, 并通过标准曲线法对释放速率做了表征。

1 材料与方法
11 1 实验材料与仪器
聚氨酯( PU ) 树脂( Dow Cor ning, U SA) ; 聚苯乙烯( PS) ( 通用, 上海赛科石油化工有限公司) ; 聚乙烯醇( PVA) ( 进口分装, 国药集团化学试剂有限公司) ; 十二烷基硫酸钠( 电子纯, 香港迪韻科技有限公司) ;苯甲酸钠( NaB) ( 分析纯, 国药集团化学试剂有限公司) ; 二氯甲烷, 三氯甲烷( 分析纯, 国药集团化学试剂有限公司) ; 正辛醇( 分析纯, 上海长城华美仪器化剂有限公司) ; 赤细菌(ºcrythrobacter sp. car-8051 株) ,分离自我国东海海域( 东经1241 605ºc, 北纬311 237) 的160m 海深海水样品。其16S rRNA 基因序列GenBank 登录号为:ºcU981822。菌株保存于上海海洋大学食品学院海洋药物实验室; 仪器设备包括:85-2 恒温磁力搅拌器; Vºcctor 22 型傅立叶变换红外光谱仪; WFX-110 原子吸收光谱分析仪; DDSJ-350电导率仪; COULTºcR N4 Plus 粒径分析仪; T MZ9-S-5200 扫描电镜等。
11 2 聚苯乙烯载药微球的制备
本文采用溶剂挥发法来制备苯乙烯微球, 首先将分散剂( PVA 或十二烷基硫酸钠) 溶解在去离子水中, 形成浓度为2%( w t) 左右的分散剂溶液, 并搅拌升温至60~ 70ºc ; 聚苯乙烯( PS) 和防污剂NaB( 1B1)加入到有机溶剂二氯甲烷或三氯甲烷中至NaB 浓度为5w t% 的悬浊液作为有机相; 将有机相液体缓慢滴加入分散相溶液中, 形成O/W 水包油分散体系, 并滴加2 滴正辛醇消泡, 控制适当的搅拌速度( 1000r/ min左右) 和温度( 20~ 30ºc ) ; 搅拌4~ 5h 将溶剂挥发, 可以得到载有防污剂NaB 的聚苯乙烯微球, 待微球壁材固化成型后将其分离过滤, 用去离子水洗涤数次以去除表面残留的溶剂, 于25~ 27ºc 真空干燥3~ 4h, 得聚苯乙烯载药微球待用。
11 3 聚苯乙烯载药微球表观形态的分析
利用扫描电镜观察不同分散剂、溶剂以及搅拌速度下制备的的苯乙烯载药微球表观形态, 包括粒径,粒径分布, 微球形貌的完整性; 优化苯乙烯载药微球的制备工艺。
11 4 红外光谱( FT-IR) 表征以及微球中防污剂载药量的检测
利用红外光谱对聚合物载药微球进行表征, 以确定有效防污成分被包埋在聚合物微球中; 聚合物微球在鉴定之前真空干燥放置48h, 测试也在干燥的环境中进行, 以避免水对测试结果的影响; 采用WFX-110 原子吸收光谱分析仪对样品中的苯甲酸钠的含量进行测定。
11 5 微球在防污涂料中的分散
以聚氨酯作为涂层基料, 乙酸乙酯做稀释剂, 与聚氨酯的质量比为1:1, 将苯乙烯微球逐步加入聚氨酯溶液中( 比例按照苯甲酸钠占聚氨酯基料的质量分数为3% ) 的防污涂层样品, 超声分散, 涂刷, 固化,在蔡司显微镜下观察微球在聚氨酯防污涂层中的分散情况。
11 6 苯甲酸钠释放速度的测定
采用标准曲线法, 利用电导率仪测定每个不同质量分数( 配制苯甲酸钠的不同含量的200mL 水溶液, 质量分数分别为0. 5%、0. 8%、1. 0%、1. 5%、2.0%、2. 5%、3. 0% ) 的防污剂水溶液的电导率, 根据每个不同质量分数及其所对应的和电导率绘制标准曲线。将防污涂料层样品放在装有200mL 的去离子水的容器中, 每两天测溶液的电导率, 根据标准曲线, 计算浓度, 再推算出苯甲酸钠的累计释放量; 并对使用微球包埋的苯甲酸钠和未经过包埋处理的苯甲酸钠的释放速度进行对比。
11 7 抑菌试验
实验将经过去离子水浸泡过的120 天的防污涂层样品进行实验室抑菌试验。采用抑菌圈法: 自海洋细菌的保存斜面上, 挑取一环置于Zobel l 2216E 液体培养基中, 置28 ºc  , 130 rpm 培养48 h 至对数生长期。使用01 9% 生理盐水对菌液进行梯度稀释, 取100 uL 均匀涂布于2216E 固体琼脂平板上。用无菌镊子取剪好的防污涂层置于已涂布菌液的固体平板表面上。置28ºc 培养箱中, 培养48 h, 待抑菌圈较明显时, 拍照记录结果。
11 8 试验网片的挂海实验
采用GB5370-85 防污漆样板浅海浸泡试验方法, 试验在福建宁德三都澳一带海水养殖海域上进行。按照国标将防污网片浸入指定的海水深度, 逐月观察网片上海洋污损生物附着种类、附着量及繁殖程度,同时与空白网片作比较。每次观察时, 首先应仔细除去附着在样板上的海泥, 观察位置应远离框架边缘20mm, 以消除边缘影响。观察时, 应尽量缩短时间, 观察后应立即将试验网片浸入海中, 以避免已附着生物的死亡, 影响试验结果。